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Caractérisation hyperspectrale en champ sombre de nanoparticules d’or : identification et localisation

La microscopie en champ sombre couplée à l’imagerie hyperspectrale fournit un moyen efficace d’étudier les nanomatériaux dans les tissus, les cellules vivantes ou dans les solutions. La lumière diffusée par les nanostructures plasmoniques ou autres types de nanostructures fournit des informations utiles sur leur composition, leur taille et leur distribution.

Photon etc. offre deux plateformes différentes pour l’imagerie en champ sombre hyperspectrale : une source laser accordable (TLS - Tunable Laser Source) permettant le filtrage en excitation et IMA, un système de filtrage en émission.

La TLS de Photon etc. est composée de deux modules : une source supercontinuum (source large bande) et un filtre accordable passe-bande (LLTF - Laser Line Tunable Filter) basé sur la technologie de réseaux de Bragg en volume (VBG - Volume Bragg Gratings) de Photon etc. IMA est composé d’un filtre hyperspectral, l’hypercube, également bâti à partir de VBG. Lorsque la TLS ou l’hypercube sont combinés avec un microscope scientifique équipé d’un condenseur pour champ sombre, ils peuvent transformer le microscope en un système d’imagerie en champ sombre hyperspectral. Ces imageurs sont accordables de manière continue dans les plages spectrales VIS (400-1000 nm), NIR (900-1620) nm ou une combinaison de ces plages (400-1620 nm). Ces plates-formes à la fine pointe de la technologie permettent une caractérisation approfondie des nanomatériaux sans aucune préparation particulière d’échantillons.

Résultats obtenus avec la TLS

Dans ce projet de Patskovsky et al. [1] des nanoparticules plasmoniques d’or (AuNP) ciblant les cellules cancéreuses du sein humain CD44+ sont étudiées par imagerie hyperspectrale en champ sombre. Cette configuration a été utilisée avec succès pour effectuer la localisation spectrale 3D et l’identification spectroscopique des nanoparticules d’or dans des préparations de cellules fixées (voir Fig. 1). « Ces informations spatiales et spectrales sont essentielles pour l’amélioration des techniques d’imagerie utilisant la nanoplasmonique et l’amélioration des techniques de détection des maladies dans des environnements biologiques complexes. »

Images en champ sombre prises sur différents plans le long de l’axe optique z à l’aide d’un objectif 100X. a) Le plan focal est positionné sur la surface du substrat en verre (points S), ou b) sur la surface supérieure des cellules cancéreuses du sein humain ou à l’intérieur de la cellule (points C). Adaptée de [1].
Fig. 1 - Images en champ sombre prises sur différents plans le long de l’axe optique z à l’aide d’un objectif 100X. a) Le plan focal est positionné sur la surface du substrat en verre (points S), ou b) sur la surface supérieure des cellules cancéreuses du sein humain ou à l’intérieur de la cellule (points C). Adaptée de [1].

En collaboration avec le professeur David Ginger de l’Université de Washington, des nanoparticules d’or de 100 nm ont été étudiées à l’aide de l’imageur hyperspectral en champ sombre de Photon etc. Les données ont été acquises de 432 nm à 849 nm avec des pas de 3 nm. La figure 2 a) et b) montre les résultats hyperspectraux et les spectres de diffusions typiques (c) extraits des données. Le décalage des longueurs d’onde peut aider à identifier la taille des particules et les informations spatiales peuvent aider à évaluer leur distribution.

a) Image en champ sombre à 576 nm extraite des données hyperspectrales, b) agrandissement de la région où les spectres ont été extraits, et c) spectres diffusés extraits - voir les cibles correspondantes.
Fig. 2 - a) Image en champ sombre à 576 nm extraite des données hyperspectrales, b) agrandissement de la région où les spectres ont été extraits, et c) spectres diffusés extraits - voir les cibles correspondantes.

Résultats obtenus avec IMA

Dans ce projet du groupe de recherche du professeur Michel Meunier de l’école Polytechnique, IMA est utilisé pour étudier des cellules cancéreuses du sein humain marquées avec des nanoparticules d’or (AuNP).

L’efficacité de transmission élevée des filtres hyperspectraux de Photon etc. permet l’acquisition rapide et en haute résolution d’images spectralement résolues. Puisque la caméra capte tout le champ de vue, il est possible de recueillir des informations en temps réel afin de suivre la dynamique des cellules et des composantes nanométriques luminescentes. PHySpec™, le logiciel de Photon etc. permet une analyse en composantes principales (ACP) en vue d’identifier et de localiser les nanoparticules présentes dans un échantillon donné.

La figure 3 a) montre une image en champ sombre de cellules cancéreuses MDA-MB-23 du sein humain marquées avec des nanoparticules d’or de 60 nm. Avec un objectif 60X, une superficie de 150 x 112 μm2 a été imagée de 400 nm à 650 nm, avec un pas de 2 nm et un temps d’exposition de 2 sec. par longueur d’onde. En quelques minutes, plus d’un million de spectres ont été collectés, chacun d’entre eux couvrant l’ensemble de la gamme visible.

Les cellules ont généralement un spectre de diffusion plat, alors que les nanoparticules d’or montrent un pic autour de 550 nm. La figure 3 b) illustre l’image en champ sombre à 550 nm, extraite du cube hyperspectral du cancer du sein. Les nanoparticules d’or sont marquées avec une coloration verte après un traitement logiciel ACP. L’agrandissement d’une cellule de cancer du sein (Figure 3 c) et les spectres des régions contenant les nanoparticules d’or (exemples sur la figure 3 d) ont confirmé la présence de nanoparticules de 60 nm.

a) Image en champ sombre de cellules cancéreuses du sein humain marquées avec des nanoparticules d’or de 60 nm, b) image monochromatique à 550 nm, AuNP marquées en vert après ACP, c) grossissement d’une cellule cancéreuse et d) spectres de diffusion de nanoparticules d’or pris à différents endroits (voir flèches correspondantes en c)).
Fig. 3 - a) Image en champ sombre de cellules cancéreuses du sein humain marquées avec des nanoparticules d’or de 60 nm, b) image monochromatique à 550 nm, AuNP marquées en vert après ACP, c) grossissement d’une cellule cancéreuse et d) spectres de diffusion de nanoparticules d’or pris à différents endroits (voir flèches correspondantes en c)).

Pour plus d’information, contactez info@photonetc.com

[1] Patskovsky, S., Bergeron, E., & Meunier, M. (2013). Hyperspectral darkfield microscopy of PEGylated gold nanoparticles targeting CD44-expressing cancer cells. Journal of Biophotonics, 8(1–2), 162–167.